Protocolos de congelación de óvulos

PROTOCOLOS DE CONGELACIÓN LENTA MODIFICADA Y VITRIFICACIÓN

En el artículo científico “Vitrificación vs Congelación de óvulos” se comparan dos métodos de preservación de los ovocitos, uno lento (congelación lenta) y otro ultrarrápido (vitrificación), en relación a la supervivencia de los ovocitos, la tasa de fecundación, el desarrollo de los embriones tras ser fecundados, la formación del huso meiótico en los ovocitos y su alineamiento cromosómico.

Los protocolos que se siguieron para realizar la congelación y descongelación lenta modificada de los ovocitos, o bien la vitrificación y desvitrificación de los ovocitos se relata a continuación:

CONGELACIÓN – DESCONGELACIÓN LENTA MODIFICADA

▬ CONGELACIÓN LENTA MODIFICADA ▬

Este método se basa en el método de congelación de Fabbri y colaboradores, para lo cual, tras denudar los ovocitos se introdujeron en medio de fluido tubárico humano (HTF) suplementado que contenía una concentración de 1,5 M de 1,2-propanodiol (PROH).

De ahí, se transfirieron durante10 minutos al medio de congelación, compuesto de 1,5M PROH y 0,3 M de sacarosa.

Los ovocitos se dividieron en grupos de 2 o de 3 y se cargaron en pajuelas que se termosellaron y se colocaron en un congelador programable a 25ºC, donde se irían enfriando poco a poco siguiendo los siguientes pasos:

I) Enfriamiento donde se baja la temperatura 2ºC cada minuto.

II) Cuando llega a 7ºC bajo cero se realiza el “seeding” manual y se mantienen a – 7ºC durante 10 minutos.

III) Se prosigue con el enfriamiento disminuyendo la temperatura 0,3ºC por minuto hasta llegar a los – 33ºC.

IV) Se sumergen en nitrógeno líquido a – 196ºC.

▬ DESCONGELACIÓN LENTA MODIFICADA ▬

Se extrajeron las pajuelas y se siguió el siguiente protocolo:

I) Se dejaron a temperatura ambiente 40 segundos.

II) Se sumergieron a 31ºC en un baño maría durante 60 segundos.

III) Se fueron lavando-hidratando de forma secuencial, para eliminar los restos de crioprotector.

IV) Se mantuvieron en medio HTF en el incubador a 37ºC durante 2-3 horas antes de microinyectarlos (ICSI).

VITRIFICACIÓN-DESVITRIFICACIÓN

▬ VITRIFICACIÓN ▬
Para proceder a la vitrificación de los ovocitos, se realizaron los pasos siguientes:

1) Se sumergieron en un medio de equilibrio, compuesto por etilenglicol (EG) y PROH (al 7,5% v/v) durante 5 minutos.

2) Se transfirieron a medio de vitrificación entre 45-60 segundos, compuesto por EG y PROH (al 15% v/v) y 0,5 M de sacarosa.

3) Se cargaron en las “cucharas” especiales para ello y se sumergieron directamente en nitrógeno líquido.

4) Se mantuvieron durante un mes vitrificados.

▬ DESVITRIFICACIÓN ▬

Se usó la misma casa comercial que para la vitrificación y se hizo lo siguiente:

1) Se introdujo la cuchara durante 1 minuto a 37º C en 1 M de sacarosa, pasando por 3 concentraciones diferentes de la misma, de forma decreciente, durante 3 minutos cada uno (1 M, 0’50 M y 0’25 M).

2) Los ovocitos se pasaron a un medio de lavado, dos veces seguidas.

3) Tras las 2-3 horas de cultivo, se examinó la integridad de la membrana y los ovocitos intactos se microinyectaron (ICSI).