Enfermedad de Huntington y Diagnóstico Genético Preimplantacional

Laura Gil Aliaga
Laura Gil Aliaga
Especialista en Reproducción Asistida
Actualizado: 8/08/2010

Tener descendencia siendo portador de la enfermedad de Huntington gracias a la utilidad de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) “One-Step Multiplex” en el Diagnóstico Genético Preimplantacional.

El objetivo del presente estudio es el de desarrollar un método de reacción en cadena de la polimerasa multiplex para realizar un diagnóstico genético preimplantacional (DGP) sobre la enfermedad de Huntington (EH) o corea de Huntington, basado en la amplificación de tripletes CAG y tres microsatélites polimórficos en un solo paso de la PCR.

Se trata de un artículo basado en técnicas e instrumentación, con sede en un centro médico con docencia, para el cual se utilizaron 36 embriones procedentes de 7 ciclos de DGP. Intervinieron pacientes que se habían sometido a un ciclo de DGP con transferencia de dos embriones no afectos de Huntington en día cinco de cultivo embrionario. El DGP se basó en la identificación de la mutación o en la exclusión de portadores de la EH, consiguiendo que se analizaran los 36 embriones con el nuevo método se desarrolló, obteniendo un resultado real para 34 de ellos. Dos embriones se transfirieron en día +5 de cultivo, consiguiendo dos embarazos de un único saco embrionario.

La conclusión del estudio es que este tipo de método es una aplicación interesante para cuando hay ciclos de DGP con múltiples marcadores o bien para otras condiciones patológicas.

Ana Peciña 1, 2, María Dolores Lozano Arana 1, Juan C. García-Lozano 1, Salud Borrego 1,2 y Guillermo Antiñolo 1,2

1 Unidad de Gestión Clínica de Genética, Reproducción y Medicina Fetal, Hospitales Universitarios Virgen del Rocío, Sevilla, España.
2 Centro de Investigaciones Biomédicas en Red de Enfermedades Raras, Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Sevilla, España.

INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Huntington (EH) o corea de Huntington es un trastorno neurodegenerativo tardío que se transmite a la descendencia de forma autosómica dominante ocasionado por una llamada mutación dinámica. Esta mutación se produce por una expansión del triplete CAG en el primer exón del gen IT15 del cromosoma 4 (4p16). Para los portadores, el diagnóstico genético preimplantacional (DGP) basado en la identificación de está mutación, ya está disponible.

Otros portadores potenciales, sin embargo, prefieren no conocer su estatus genético, pero aún así, van a evitar tener descendencia portadora de la enfermedad. Para estos pacientes, los embriones que se obtengan de un ciclo de DGP tienen que seleccionarse entonces, bien por amplificación del triplete CAG de los embriones sin comunicar el resultado a los progenitores, o bien por exclusión.

Nosotros hemos presentado con este estudio una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex fluorescente, basado en la amplificación de los tripletes de CAG, en tres microsatélites polimórficos diferentes comúnmente utilizados para el diagnóstico de la EH, gracias al diagnóstico genético preimplantacional de una célula embrionaria.

MATERIALES Y MÉTODOS

El ADN genómico se obtiene a partir de sangre total. Las estimulaciones ováricas, captaciones ovocitarias y las técnicas de inyección intracitoplásmica (ICSI) se llevaron a cabo según los protocolos estándar.

Las blastómeras fueron biopsiadas usando un sistema de láser diodo, de no contacto, de 1,48 micrometros (OCTAX; Olympus, Tokyo, Japón). Cada blastómera se transfirió a un tubo con medio de reacción que contenía 2,5 microlitros de tampón de lisis (200 mM NaOH, 50 mM DTT) y se congelaron a –80ºC antes de que se produjera la lisis celular.

Las células se lisaron mediante una incubación de diez minutos a 65ºC antes de añadir los reactivos para realizar la PCR.

Se llevó a cabo la PCR multiplex de una sola célula, para poder realizar el diagnóstico genético preimplantacional de la corea de Huntington. Se amplificaron los tripletes de CAG mediante un marcador intragénico (I1CAHD) y dos marcadores génicos flanqueantes de la EH (D4S412 y D4S127), con el sistema de PCR ya nombrado utilizando el QIAGEN Multiplex PCR kit (QIAGEN GmbH; Hilden, Alemania).

La mezcla de reacción contenía 200 mM de Tricina, un pH de 4,93, 2.10-6M de cada encebador, 5 x Sol Q y 2 x QIAGEN Multiplex PCR Master Mix para conseguir un volumen final de 25 microlitros.

El programa de la PCR se efectuó como seguidamente mostramos:
– 15 minutos a 95ºC.
– 10 ciclos de 30 segundos a 96ºC.
– 1 minuto a 63ºC.
– 90 segundos a 72ºC.
– 30 ciclos de 30 segundos a 94ºC.
– 1 minuto a 63ºC.
– 90 segundos más a 72ºC.
– y una extensión final de 15 minutos a 60ºC.

Un cebador de cada par fue marcado con fluorescencia. Las secuencias de los encebadores están descritas en cualquier libro pertinente, no es necesario escribirlas. Los productos de la PCR se analizaron en un autosecuenciador automático ABI3730 (Applied Biosystems, Foster City, CA).

RESULTADOS

Se llevaron a cabo 7 ciclos de diagnóstico genético preimplantacional usando el método descrito previamente. Se extrajeron dos blastómeras de cada uno de los 36 embriones analizados, obteniendo un resultado para 34 de ellos, es decir el 94,4% de éxito.

Tan sólo se transfirieron dos embriones de los siete ciclos estudiados, pero ambos resultaron en dos embarazos únicos, respectivamente.

Una de las dos mujeres embarazadas pidió, además, un screnning prenatal que se realizó mediante el análisis de las vellosidades coriónicas, coincidiendo con los resultados generados por el DGP gracias a la amplificación de ADN por PCR.

DISCUSIÓN

La coamplificación de los tripletes CAG y tres marcadores de diferentes microsatélites proporciona más información que los protocolos publicados previamente, además de que puede ser usado para personas de riesgo, portadoras, que no quieren someterse a un diagnóstico presintomático de la mutación.

Este método implica sólo una ronda de PCR individual, lo que supone un descenso en la contaminación, en el tiempo requerido y del coste por cada ciclo de DGP.

Este ensayo no sólo permite la detección de una posible contaminación, sino que además nos permite detectar el diagnóstico genético indirecto, hecho que aumenta la fiabilidad de los resultados. Por eso, una de las mejores utilidades que se le puede sacar a este tipo de ensayo se da para cuando se van a realizar ciclos de DGP con numerosos marcadores para usar.

Además también se puede usar este tipo de técnicas para otras patologías como la fibrosis quística, la atrofia muscular espinal y la distrofia muscular de Duchenne.

Fuente: Fertility and Sterility, vol. 93, nº 7, pp. 2411-2412, 2010.

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