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Ovario artificial

Laura Gil Aliaga
Laura Gil Aliaga
Especialista en Reproducción Asistida
Actualizado: 31/10/2010

Maduración in vitro de ovocitos a partir de un ovario humano artificial prefabricado.

El fallo ovárico es el mayor obstáculo con el que se encuentran las mujeres en edad reproductiva que desean concebir después de un tratamiento con quimioterapia o radioterapia por cáncer. Las pacientes que han sido diagnosticadas de cáncer tienen un tiempo muy breve para poder conservar su fertilidad antes de empezar con el tratamiento contra el mismo.

Dichas pacientes normalmente están limitadas a un único tratamiento de fecundación in vitro con embriones u ovocitos congelados antes de iniciar el tratamiento anticancerígeno que daña la foliculogénesis ovárica.

Algunos centros criopreservan tejido ovárico para futuros autotransplantes o maduración de ovocitos inmaduros pero este tipo de técnica tiene una duración limitada en el tiempo.

Teóricamente, la maduración in vitro de ovocitos primordiales (MIV) promete alcanzar un número bastante elevado de ovocitos maduros para reproducciones futuras. A día de hoy, esta técnica de madurar ovocitos in vitro sólo ha resultado exitosa en ratones.

Recientemente, nuestro grupo ha creado un modelo de autoensamblaje tridimensional a partir de células individuales dispersas. Dichas células se esparcían en unos micro-moldes de agarosa, los cuales permitían el autoensamblaje de los microtejidos. Estos microtejidos pueden, a su vez, ligarse entre ellos creando por tanto, microtejidos cada vez más complejos.

Este sistema ha sido usado para crear un ovario humano artificial compuesto por los tres tipos celulares funcionales del ovario: de la teca, de la granulosa y ovocitos.

Nuestra hipótesis es que, a partir de las tres dimensiones, la interacción de las células podría hacer que se asemeje a la realidad produciendo una maduración folicular hecho que serviría para comprobar la fisiología folicular y la toxicología.

Stephan P. Krotz a, Jared C. Robinsa , Toni-Marie Ferruccio d, Richard Moore b, Margaret M. Steinhoff c, Jeffrey R. Morgan d, Sandra Carson a.

aDivision of Reproductive Endocrinology & Infertility, Department of Obstetrics & Gynecology, Women & Infants Hospital, Alpert Medical School, Brown University, Providence, RI 02905, USA.
bProgram in Women’s Oncology, Department of Obstetrics & Gynecology, Women & Infants’ Hospital, Alpert Medical School, Brown University, Providence, RI 02905, USA
cDepartment of Pathology, Women & Infants’ Hospital, Alpert Medical School, Brown University, Providence, RI 02905, USA
dDepartment of Molecular Pharmacology, Physiology & Biotechnology, Center for Biomedical Engineering, Brown University, Providence, RI 02912, USA

Aislamiento células de la teca

Este material se consiguió de mujeres entre los 25 y los 46 años que habían sido diagnosticadas para realizarles una ooforectomía por indicación benigna, de acuerdo con protocolo IRB aprobado del Hospital de Mujeres e Infantes.

Para ello, las secciones de tejido ovárico (2×1 cm) se colocaron en medio Dulbeco (DMEM) (InvitrogenTM) con un 10% de suero fetal bovino (FBS) (Hyclone Laboratories Inc, Logan, Utah), con un 1% de penicilina / estreptomicina (MP Biomedicals LLC, Solon, Ohio) y 2.8 μg/ml de anfotericina B (Fischer-Scientific, Pittsburgh, PA) (Medio de Cultivo Ovárico).

Los folículos antrales se extrajeron del tejido y se colocaron en una placa de Petri de 35 mm. Éstos fueron biseccionados y la cara interna de los mismos se raspó suavemente con una espátula para extraer la células de la granulosa.

La pared del folículo se lavó con medio de cultivo ovárico seguido de medio de cultivo tamponado (PBS). Se separó en segmentos de 1-2 mm y se digirió a 37ºC durante una hora en 15 ml de DMEM que contenía, además, 120 mg de colagenasa (0,5%) (InvitrogenTM).

Las células y el tejido, que no se digirió con enzimas, se centrífugo a 800 rpm durante 5 minutos y se resuspendió en 25 ml Versene (1% EDTA en PBS). Esto se repitió dos veces más. Tras la tercera centrifugación, las células y el tejido se resuspendieron nuevamente en 25 ml de medio de cultivo ovárico y se distribuyó en seis placas de petri con 2 ml de la alícuota en cada una de ellas.

Éstas se cultivaron toda la noche a 37ºC tras lo que el tejido no digerido se eliminó. Tras 48 horas de cultivo, las células se tripsinizaron con 1 ml de tripsina al 0,25% (InvitrogenTM) por placa durante cinco minutos y a 37ºC. Además, se añadieron 2 ml de medio de cultivo ovárico a cada una de las placas y las células que había en suspensión se contabilizaron con un hemocitómetro.Se contaron 2 millones de células por recipiente, con cultivos de 25 ml, el cual se cambiaba cada dos días.

Criopreservación células de la teca

La teca se tripsinizó y recogió en un tubo cónico con 50 ml. Se concentró un millón de células en 900 μl de medio de cultivo ovárico. Se añadieron cien microlitros de dimetil-sulfóxido (DMSO) (ACROS, Morris Plains, NJ) a la suspensión celular.

Se hicieron alícuotas de un mililitro de volumen de la solución del 10% del DMSO, que se introdujeron en crio-viales y se almacenaron en alcohol isopropilo durante toda la noche a -80ºC y transferidos al criobanco también a -80ºC. Para su uso, los viales se descongelaron a temperatura ambiente y las células se cultivaron inmediatamente en una placa con medio de cultivo ovárico.

Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se llevó a cabo mediante el protocolo Autostainer de EnVision+™ Dual Link HRP (DAB+) (Dako North America, Carpinteria, CA).

Diseño del molde de polidimetilsiloxano

Los moldes de PDMS se diseñaron usando un programa computerizado (CAD) (Solid Works Corporation; Concord, MA) y para hacer los moldes de cera se utilizó una máquina de prototipado rápido ThermoJet (3D Systems Corporation—Valencia, CA).

Los moldes se recubrieron con Reprorubber (16116, Flexbar Machine Corporation; Islandia, NY) un material sintético que funde y que se retiró tras la solidificación, para conseguir un réplica negativa del mismo molde que ya teníamos.

Éstos se rodearon con parafilm (16136, Flexbar) y se rellenó con polidimetilsiloxano (PDMS; Dow Corning, Midland, MD) en incubado durante dos horas a 95ºC. Las réplicas positivas de PDMS se eliminaron del Reprorubber y se incubaron durante una hora.

Formación del microgel de agarosa

Se echó 3 ml de agarosa (Powder Ultrapure Agarose 15510-027, InvitrogenTM) ultrapura y autoclavada al 2% en los moldes de PDMS. El gel de agarosa solidificado se retiró del molde de PDMS tras 15 minutos. Los moldes se equilibraron con dos ml. De medio de cultivo ovárico en una placa de cultivo a 37ºC. El medio se cambió dos veces más con cuatro horas de diferencia del primer cultivo.

Formación y caracterización de células de la teca esferoides

Las células de la teca se lavaron con Versene antes de la digestión con tripsina (0.25% trypsin) durante cinco minutos y a 37ºC de temperatura. La adición de un volumen igual de medio de cultivo ovárico al de la tripsina paró el proceso de digestión enzimática.

La suspensión celular se centrifugó a 800 rpm durante 5 minutos. Aproximadamente, ochocientas mil células se concentraron en los 250 μl de medio de cultivo ovárico y se llevaron al interior de los moldes esféricos que contenían 822 pocillos.

Las células se fotografiaron a la hora, a las 4 horas, a las 24 horas y a las 48 horas.

Ensayo de viabilidad celular

El medio que se encontraba en el pocillo de agarosa se aspiró y el gel que contenía los esferoides se sumergió en 2.5 ml de PBS durante cinco minutos. Se aspiró el PBS y se añadieron 300 μl de solución de viabilidad a cada uno de los geles. Esta solución de viabilidad (InvitrogenTM) se fabricó mezclando 2.5 μl Calcein-AM, 10 μl del homodímero-1 de etidio y 5 ml de PBS. El gel se incubó en la oscuridad durante 30 minutos tras los cuales se lavó con PBS durante 5 minutos más.

Aislamiento de las células de la granulosa y formación de esferoides

El cúmulo de células de granulosa se separó de los ovocitos de las pacientes de fecundación in vitro y se cultivaron en una placa Petri de 35 mm con PBS. La sangre y tejido se eliminó con un pipeta de vidrio.

Aproximadamente 900.000 células de la granulosa se resuspendieron en 250 μl de medio de cultivo ovárico y se añadieron a los micro-moldes de garosa durante 42 horas antes de colocarlos en los panales de células de la teca.

Construcción de ovario artificial células de granulosa esferoides

Se concentraron aproximadamente 2,7 millones de células de la teca en 400 μl de medio de cultivo y se añadieron a 18 pocillos en forma de panal dentro del molde de agarosa. Tras 18 horas, los microtejidos que se habían formado se transfirieron con una espátula estéril a una placa Petri de 35 mm, depositándose en 2 ml de agarosa estéril solidificada.

Se añadió medio de cultivo suficiente sólo para cubrir los pocillos en forma de panal. Los esferoides de célula de la granulosa, cultivados durante 42 horas, se rescataron del medio y se centrifugaron durante 5 minutos a 500 rpm. El resultado de este procedimiento se cultivó de nuevo, durante 48 horas, en las tecas artificiales.

Construcción ovario artificial con complejos cúmulo de granulosa-ovocito

Los complejos cúmulo-ovocito se extrajeron los folículos antrales tempranos (inferior a 10 mm) de mujeres que se iban a someter a una oforectomía vía punción folicular con una aguja del calibre 27 seguido de un lavado con DMEM. Los folículos se abrieron y se lavaron con DMEM en una placa de Petri.

Los ovocitos se rescataron del medio y se transfirieron a gotas de 60 μl con medio HEPES (tampón de CO2 para mantener el ph) (Sage-Cooper Surgical, Pasadena, CA) en una placa Petri diferente, utilizando para ello una pipeta Drummond de 3 μl (The Drummond Scientific Co, Broomall, PA).

Finalmente, se lavaron con Versene y se tripsinizaron también un total de 550.000 células de la teca y se concentraron en 60 μl de medio SAGE® IVM (Sage-Cooper Surgical) que contenía un 10% de albúmina (Sage-Cooper Surgical), hormona folículo-estimulante (FSH) (75 mIU/ml of Repronex®) (Ferring, Parsippany, NJ) y gonodatropina coriónica humana (hCG) (100 miu/ml Novarel®) (Ferring).

Las células de la teca se transfirieron al molde de agarosa que contenía dos pocillos donde se añadirían los ovocitos, un poco más tarde, para dejarlos en cultivo toda la noche y comprobar la maduración un tiempo prudencial después. Las pacientes que aportaron los complejos cúmulo-ovocito no tenían la misma edad que las que aportaban las células de la teca.

El cultivo se fue cambiando de medio, según las necesidades y el estadio de los ovocitos y las células de su alrededor, para tratar de obtener su maduración con la consecuente extrusión del primer cuerpo polar.

Resultados

La células de la teca y de la granulosa sí se agregaron formando microtejidos complejos llegando a ser viables una semana incluso.

A las 72 horas de la construcción del ovario artificial, las células de la teca estaban ya completamente rodeadas de esferoides o los complejos cúmulo-granulosa-ovocitos se encontraban sin invasión del estroma con sus límites bien establecidos.

La extrusión del cuerpo polar sí se produjo en uno de los tres complejos cúmulo-granulosa-ovocitos evaluados.

Conclusión

Se puede crear un ovario artificial humano con células de la teca humanas y microtejidos a partir de células de la granulosa. Éste podrá ser utilizado para maduración in vitro de los ovocitos y futuros estudios de toxicología en los ovocitos.

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