Birrefringencia de la zona pelúcida

La birrefringencia de la zona pelúcida en la maduración de los ovocitos.

La zona pelúcida es una capa extracelular que rodea al ovocito desde la ovulación, pasando por la fertilización y el desarrollo embrionario temprano. Esta capa es una matriz dinámica compuesta por filamentos organizados en capas en diferente orientación de forma que, se ha observado, que esto puede reflejar la maduración citoplasmática del ovocito. Se ha descrito que una mayor intensidad de birrefringencia en la capa interna de la ZP de los ovocitos se asocia a un elevado potencial de implantación de estos ovocitos una vez fecundados.

En el siguiente estudio se evalúa la birrefringencia zona pelúcida en los ovocitos inmaduros y maduros recogidos tras la punción folicular, tras una estimulación ovárica controlada y se estudia la influencia de este parámetro en el desarrollo de los ovocitos. Se observa, además, que el porcentaje de ovocitos con alta birrefringencia es mayor en los ovocitos inmaduros que en los maduros. Sin embargo, no se observó ninguna influencia de la birrefringencia de la zona pelúcida al madurar in vitro los ovocitos inmaduros.

Por otra parte, se vio que la tasa de fertilización fue mayor en aquellos ovocitos con alta birrefringencia en la zona pelúcida. En el caso de los ovocitos MII que no habían sido madurados in vitro, aquellos que presentaban una alta birrefringencia, formaban embriones de mayor calidad que los que tenían baja birrefringecia.

Daniela Paes de Almeida Ferreira Braga a, Rita de Cassia Savio Figueira a,Priscila Queiroz a, Camila Madaschi a, Assumpto Iaconelli a, Edson Borges b

a Fertility—Assisted Fertilization Center, Sao Paulo, Brazil
b Sapientiae Institute—Educational and Research Center in ssisted Reproduction, Sao Paulo, Brazil

Durante los tratamientos de reproducción asistida, las mujeres suelen ser sometidas a una estimulación ovárica controlada. Para ello, se les administra agonistas o antagonistas de la Gn RH mediante los cuales se bloquea la acción de la hipófisis pudiendo estimular los ovarios con gonadotropinas que inducen el desarrollo y maduración de múltiples folículos.

Tras la estimulación con gonadotropinas y debido a la falta de sincronización en la maduración, tras la punción folicular se suelen recuperar ovocitos en diferentes etapas de desarrollo. De ellos, algunos ovocitos inmaduros en estado de profase I o metafase I tienen potencial para poder desarrollarse y sufrir una maduración nuclear. Por ello, la maduración in vitro de estos ovocitos inmaduros puede ser una manera de aumentar el número de embriones obtenidos en estos tratamientos, lo que es importante en el caso de pacientes bajas respondedoras o pacientes con un reclutamiento folicular no sincrónico.

La maduración in vitro de ovocitos es un proceso poco conocido y se define como el tiempo necesario para que un ovocito en estado de vesícula germinal realice los cambios nucleares necesarios para poder llegar a la expulsión del primer cuerpo polar. Sin embargo, se ha visto que estos cambios no se relacionan necesariamente con la capacidad de desarrollo del embrión. Se han realizado varios intentos con el fin de promover la maduración de ovocitos inmaduros recuperados en ciclos de estimulación ovárica controlada, obteniéndose tasa óptima de fertilización. A pesar de esto, los resultados en cuanto a desarrollo óptimo del embrión y tasa de embarazo son todavía escasos.

La microscopía de luz polarizada ha permitido la evaluación de las características subcelulares de los ovocitos, entre las que tenemos la zona pelúcida (ZP). La zona pelúcida es una capa extracelular que rodea al ovocito desde la ovulación, pasando por la fertilización y el desarrollo embrionario temprano. Esta capa es una matriz dinámica compuesta por filamentos organizados en capas en diferente orientación de forma que se ha visto que esto puede reflejar la maduración citoplasmática del ovocito.

En referencia a ello, se ha demostrado que existe una correlación entre la birrefringencia de la zona pelúcida y el potencial de desarrollo embrionario. Es por ello por lo que el objetivo de este estudio es evaluar la birrefringencia de la zona pelúcida de los ovocitos maduros e inmaduros y evaluar si esta influye en la maduración in vitro, fertilización y desarrollo embrionario.

MATERIAL Y MÉTODOS

En el estudio se incluyen un total de 346 ovocitos recuperados de los ciclos de estimulación ovárica controlada de 30 pacientes sometidas a ICSI.

La estimulación ovárica controlada se realizó utilizando un protocolo largo, con agonistas de la GnRH y FSH recombinante. La punción folicular se realizó a las 35 horas tras la administración de la HCG, mediante ecografía transvaginal.

Los ovocitos obtenidos fueron clasificados según la birrefringencia de la zona pelúcida en: ovocitos con alta birrefringencia o con baja birrefringencia. De todos los ovocitos evaluados se obtuvieron 229 metafase II, 45 metafase I y 69 vesículas germinales (en estado de profase I). De este modo, se observó la influencia de la birrefringencia de la zona pelúcida en la maduración in vitro de los ovocitos inmaduros, así como la tasa de fertilización y calidad embrionaria posterior.

Para que los ovocitos inmaduros recuperados en la punción folicular madurasen, se dejaron en cultivo en medio G1 a 37 ° C y 6% de CO2. Tras 24 horas de cultivo, estos ovocitos habían sufrido la maduración nuclear y alcanzaron el estadio de MII. Tras este periodo madurativo, se microinyectaron con los espermatozoides correspondientes.

Para realizar la microinyección, se utilizó un microscopio invertido con el cual y mediante un programa informático se podía observar, mediante luz polarizada, la birrefringencia de la zona pelúcida. Dependiendo de la intensidad y la uniformidad de la birrefringencia, los ovocitos fueron clasificados como de alta o baja birrefringencia.

La fertilización de los ovocitos microinyectados se evaluó 18 horas después de ICSI y se consideró que la fertilización era normal cuando existían dos pronúcleos. La calidad de los embriones se evaluó mediante un microscopio invertido con el cual se registraron los siguientes parámetros: la fragmentación del número de blastómeras, la variación en la simetría de las blastómera, la presencia de multinucleación y defectos en la ZP y el citoplasma.

La transferencia de embriones se llevó a cabo el tercer día de desarrollo, considerándose embriones de alta calidad aquellos que presentaban las siguientes características: 8-10 células, menos del 20% de fragmentación, blastómeras simétricas, ausencia de multinucleación, el citoplasma incoloro con granulación moderada y sin inclusiones, falta de granularidad espacio perivitelino y la ausencia dismorfismo de ZP. Los embriones que carecen de cualquiera de las características anteriores se consideraron de baja calidad.

RESULTADOS

Relación entre la birrefringencia de la Zona Pelúcida y la maduración in vitro de ovocitos.

El número total de ovocitos recuperados fue de 346, de los cuales 229 (66,2%) estaban en el estadio de MII, 48 (13,9%) estaban en la etapa de MI, y 69 (19,9%) estaban en la etapa de profase o vesícula germinal. De los ovocitos inmaduros, un 75% de los que estaban es estado de Metafase I y un 37,6% de los que estaban en profase I, se convirtieron en metafase II tras el cultivo in vitro.

El porcentaje de ovocitos con alta birrefringencia en la ZP fue mayor en los ovocitos inmaduros que en los maduros y dentro de los inmaduros, presentaban mayor birrefringencia los ovocitos en estadio de profase que los que estaban en metafase I. Además, se observó que si se comparaba el porcentaje de ovocitos inmaduros con alta birrefringencia en la ZP antes y después de la maduración in vitro, esta disminuía tras la maduración espontánea.

La microinyección intracitoplasmática de espermatozoides se realizó tanto a los ovocitos maduros recuperados tras la punción folicular, como a los ovocitos maduros obtenidos tras maduración in vitro.

Se observó que la tasa de fertilización fue mayor en aquellos ovocitos con alta birrefringencia en la zona pelúcida. En el caso de los ovocitos MII que no habían sido madurados in vitro, aquellos que presentaban una alta birrefringencia, formaban embriones de mayor calidad que los que tenían baja birrefringecia.

DISCUSIÓN

Los ciclos de fecundación in vitro suelen ser estimulados con gonadotropinas a dosis elevadas lo que genera un ambiente hormonal suprafisiológico que induce el crecimiento de una cohorte de folículos que, en condiciones naturales, se convertiría en atrésicos.

Se ha visto que los ovocitos recuperados tras la punción folicular pueden estar en diferentes etapas de madurez meiotica y que algunos de ellos pueden completar su proceso madurativo tras un cultivo in vitro.

La identificación de marcadores predictivos para el desarrollo de los ovocitos antes de la fertilización es una de las áreas más estudiadas en el campo de la medicina reproductiva. La introducción de la microscopía de luz polarizada ha permitido la visualización de forma no invasiva de las estructuras subcelulares en ovocitos como es el caso de la ZP.

Con ello, se ha visto que existe una relación entre la birrefringencia de la ZP y la calidad embrionaria. Varios estudios demuestran que los ovocitos con alta birrefringencia generan embriones con una mayor tasa de implantación y embarazo. Estos estudios están de acuerdo con el presente en el que se demuestra que la puntuación de la birrefringencia de la ZP influye tanto en la tasa de fertilización como en la calidad embrionaria. Sin embargo, esto no sucede en los ovocitos madurados in vitro y por lo tanto, aunque se ha demostrado que la birrefringencia zona pelúcida puede afectar el desarrollo del ovocito, este efecto sería difícil de observar en ovocitos madurados in vitro.

Por lo tanto, en este estudio se sugiere que la birrefringencia ZP puede ser una herramienta útil para predecir el desarrollo embrionario de los ovocitos MII. Por otra parte, se sugiere que los cambios nucleares producidos en el proceso de maduración in vitro de ovocitos puede no producir cambios moleculares por lo que estos ovocitos no adquieren las características necesarias para dar tasas de fertilización e implantación óptimas. A pesar de que la maduración nuclear se puede producir fácilmente, la maduración del citoplasma no parece que ocurra correctamente. Esto está de acuerdo con varios estudios en los que se observa una mayor incidencia de errores meióticos como consecuencia de una maduración citoplasmática defectuosa o la pérdida de sincronía entre maduración nuclear y citoplasmática.

Además, la relación entre la madurez citoplasmática y la birrefringencia de la zona pelúcida necesita de estudios más amplios para poder ser relacionadas.

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